Conservarea evolutivă a unei căi de reglare a eritropoiezei la vertebratele poikiloterme

Animale și probe de sânge

Torpile juvenile și adulte (două exemplare de Torpilă de marmură Risso, un mascul și o femeie, șapte exemplare de Torpedo ocellata Rafinesque, doi masculi și două femele, cântărind 500–600 g, și trei mostre, două femele și un mascul, cântărind 300 g), șase exemplare (2 T. marmorata și 4 T. ocellata) folosite ca martori și 20 de exemplare de țestoase căuțane Caretta caretta (cu greutatea cuprinsă între 1,33–53,78 kg, 8 masculi și 12 femele) au fost prinși în golful Napoli și în Marea Adriatică și Tireniană, au fost ținute în rezervoare de dimensiuni adecvate umplute cu apă de mare curgătoare la 18–20 ° C și hrănite în mod regulat pește proaspăt și moluște la stația zoologică din Napoli. Toate animalele utilizate în prezentul studiu au fost sănătoase, după cum se confirmă prin hemograma efectuată.

Toate torpilele erau similare ca greutate; au fost împărțiți în două grupe (tratați și martori) după specie și sex.

Probele de sânge de torpilă au fost prelevate rapid din vasul caudal folosind o seringă de 2,5 ml și colectate în tuburi care conțineau anticoagulant EDTA și frotiuri subțiri de sânge pentru microscopie luminoasă au fost făcute imediat cu sânge neanticoagulat. Sângele a fost centrifugat la 1000 rpm timp de 15 minute și s-au separat două fracții de eritrocite: nivelul bogat în eritrocite imature (sub stratul de leucoplast eliminat al coloanei de celule roșii) și celulele roșii mature (regiunea profundă a coloanei de celule roșii). ). Cele două probe au fost apoi supuse liofilizării și utilizate pentru testele ulterioare.

Probele de sânge de țestoasă au fost extrase rapid din sinusul venos occipital dorsal în tuburi evacuate care conțineau 0,1% heparină de litiu (BD, Buccinasco, Milano, Italia). Țestoasele stabulate au colaborat activ la retragerea sângelui, coborând capul, așteptând peștele premiu în urma recoltării sângelui. Frotiurile subțiri au fost făcute imediat din sânge non-anticoagulat și s-au efectuat reacții citochimice.

Îngrijirea peștilor, protocoalele experimentale și toate metodele au fost efectuate în conformitate cu ghidurile și reglementările relevante. Studiul a fost realizat în conformitate cu liniile directoare ARRIVE și a fost aprobat de „Comitetul pentru protecția animalelor utilizate în scopuri experimentale și alte scopuri științifice al Universității din Napoli Federico II”.

Iradierea cu torpile

Torpilele au fost iradiate la 40 și 90 Gray (Gy) folosind acceleratorul liniar (Siemens) pentru a studia modificările induse de radiații asupra mecanismelor apoptotice care reglează eritropoieza. Animalele au fost ținute în rezervor cu apă de mare circulantă și după șapte zile post-iradiere și ulterior o dată pe săptămână au fost prelevate probe de sânge din vena caudală, așa cum este descris, pentru a efectua hemograma, frotiuri de sânge și metodele descrise.

Imunocitochimia la microscopie ușoară

Frotiurile de sânge au fost fixate în paraformaldehidă 4% timp de 2 minute și apoi spălate în apă distilată. A fost efectuată tehnica de demascare a antigenului la temperatură înaltă folosind tampon citrat. A fost folosit un cuptor cu microunde (MW 310 DeLonghi, Treviso, Italia). Frotiurile de sânge au fost scufundate în tampon citrat 10 mM (pH 6,0) și au fost puse la microunde la 400 W 2 tratamente de 2 ori timp de 5 minute. Ulterior, frotiurile au fost lăsate în tampon citrat la temperatura camerei timp de 20 de minute.

Frotiurile de sânge au fost spălate și au reacţionat timp de 15 minute în 3% H2O2 pentru a inactiva activitatea peroxidazei endogene și a incubat timp de 60 de minute la temperatura camerei în ser normal de capră 5% (NGS; Dako, Glostrup, Danemarca) în soluție salină tamponată cu fosfat 0,1 M pH 7,4 (PBS), care conține 0,1% Triton X-100 (Sigma). , St. Louis, MO). Frotiurile au fost apoi incubate peste noapte, într-o cameră umedă, în anticorpi policlonali de iepure care recunosc Bcl-2 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) diluați 1:100 în NGS. După mai multe clătiri, frotiurile au fost incubate timp de 2 ore în IgG anti-iepure de capră biotinilate (Vector Laboratories, Burlingame, CA) diluate 1:50 în NGS, urmate de incubare timp de 1 oră la temperatura camerei în soluție de avidină – biotin-peroxidază. (ABC Kit; Vectastain, Vector) în PBS și apoi timp de 10 minute în 0,05% 3’3’diaminobenzidină (DAB) și 0,01% H2O2 în 0,01 M Tris – soluție salină tamponată cu HCI, pH 7,6 (TBS). Frotiurile de control negative au fost procesate cu același protocol, omițând anticorpul primar. Nu a fost detectată imunocolorare în aceste secțiuni.

Aceeași procedură a fost urmată pentru Bcl-XL şi imunocolorarea Bax utilizând anti-Bcl-X policlonal de iepureL și anticorpi anti-Bax (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA; diluat 1: 100 în NGS).

Izolarea mitocondriilor de celule roșii din sânge

Izolarea mitocondriilor de celule roșii din sânge a fost descrisă de Pica și colab.6. Pe scurt, celulele roșii din sânge au fost centrifugate la 800g timp de 15 minute pentru a obține o granulă mitocondrială care a fost apoi fixată pentru microscopie electronică. Peletul celular a fost diluat de trei ori cu soluție tampon (800 mM zaharoză, 2 mM K-EDTA, 10 mM Tris, pH 7,4) și incubat cu 200 μg/mL digitonină timp de 15 minute la 4 ° C. După o centrifugare la 8000g, 4 ° C timp de 10 minute, peletul de celule permeabilizate fără Hb a fost resuspendat în același volum inițial al soluției tampon anterioare și incubat cu 400 μg/mL lizozim și 200 μg/mL nagarse timp de 20 de minute la 4 ° C. Această suspensie celulară a fost apoi perturbată la 0 ° C cu un omogenizator Potter – Elvehjem. Omogenatul a fost centrifugat la 1500g iar supernatantul colectat prin filtrare cu fibră de sticlă și centrifugat de două ori la 7000g. Peletul mitocondrial a fost resuspendat, centrifugat la 22.000g timp de 10 min. Peletul mitocondrial a fost colectat în soluție tampon la o concentrație de 5-6 mg prot/mL. Concentrația de proteine ​​a fost determinată prin metoda Bradford.

Izolarea mitoplastelor

Globulele roșii au fost centrifugate la 14000g timp de 10 min și resuspendat în soluție salină tamponată cu fosfat (PBS) care conține 5 mM NaF, 500 nM acid okadaic și 1 mM ortovanadat de sodiu ca inhibitori de fosfatază. Concentrația de proteine ​​a fost determinată utilizând metoda Bradford și s-a adăugat digitonină (0,2 mg/mg de proteină) în suspensia celulară. Proba a fost incubată în gheață timp de 10 minute și ulterior diluată de cinci ori în PBS și centrifugata la 10.000g timp de 10 min. Supernatantul care conține fracțiunea citosolică a fost îndepărtat și peletul de mitoplaste a fost resuspendat în PBS și recentrifugat pentru a îndepărta reziduurile de digitonină, așa cum este descris de Technikova-Dobrova și colab..30.

Microscopia imunoelectronică

Peletul de celule roșii din sânge și mitocondriile izolate au fost fixate în glutaraldehidă 0,1% și paraformaldehidă 2% în tampon cacodilat de sodiu 0,1 M, timp de 30 de minute și spălate în tampon cacodilat de sodiu 0,1 M timp de 1 oră la 37 ° C, postfixat cu OsO4 1% pt. 1 oră, deshidratat într-un gradient de etanol, încorporat în rășină Epon 812 și polimerizat timp de 24 de ore la temperatura camerei și 24 de ore la 60 ° C. Pentru studiile imunoelectronilor, secțiunile ultrasubțiri au fost procesate în conformitate cu o procedură imunogold post-înglobare. Secțiunile ultrasubțiri au fost realizate folosind un ultramicrotom Reichert, iar secțiunile au fost montate pe grile de nichel.

Tehnica de demascare a antigenului la temperatură înaltă a fost efectuată utilizând tampon citrat și un cuptor cu microunde. Secțiunile, după ce au fost așezate pe grătare, au fost înmuiate în tampon citrat 10 mM, pH 6,0, în borcane de plastic cu capac și au fost puse la microunde la 400 W (2 tratamente timp de 5 min) și apoi grilele au fost lăsate în tampon citrat la temperatura camerei pentru 20 min. Secțiunile au fost incubate în peroxid de hidrogen 10% timp de 10 minute, clătite în PBS timp de 15 minute și blocate timp de 15 minute în albumină serică bovină (BSA) 1% în PBS. Secțiunile au fost apoi incubate cu anti-Bcl-2, anti-Bcl-X de iepureL și anti-Bax (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) (diluție 1:50) peste noapte la 4 ° C, urmat de anticorpi secundari anti-iepure marcați cu aur coloidal de 25 nm (Aurion, Țările de Jos, 1:20) timp de 2 ore la temperatura camerei. Secțiunile au fost clătite în PBS (pH 7,4) și apă distilată înainte de contracolorare cu acetat de uranil și citrat de plumb. Secțiunile ultrasubțiri au fost examinate cu un Philips 400-TEM.

Cuantificarea etichetării imunoaurului în microscopia electronică cu transmisie

Cuantificarea etichetării imunoaurului în microscopia electronică cu transmisie a fost detectată prin numărarea tuturor particulelor de aur per unitate de suprafață (µm2), conform lui D’Amico et al.31. Toate valorile au fost exprimate ca medii ± abaterea standard a trei experimente diferite (p <0,5).

Electroforeză, imuno- și western blot

Granulele de mitoplaste și mitocondriile netratate au fost resuspendate în tampon de liză (50 mM Tris-Cl, 15% glicerol, 2% β-mercaptoetanol, 5% dodecil sulfat de sodiu, pH 6,8) și supuse la electrododecilsulfat de sodiu – poliacrilidă gelică. (SDS-PAGE) (12% poliacrilamidă, 1% SDS). Proteinele separate au fost ulterior electro-transferate într-o membrană de filtru de nitroceluloză, activată anterior prin imersare într-un tampon de blotting (glicină 200 mM, Tris 25 mM, metanol 20%, SDS 0,1%) timp de 30 de minute.

După 1 oră, membrana filtrului de nitroceluloză a fost spălată în tampon TTBS (20 mM Tris/HCl, 0,5 M NaCl, 0,005% PBS-Tween, pH 7,5) și incubată peste noapte cu anticorp primar policlonal anti-iepure anti-Bax (Santa Cruz Biotechnology). , Santa Cruz, CA; 1: 100 în TTBS). După spălare, membrana a fost incubată cu un anticorp secundar de capră anti-iepure marcat cu peroxidază (Vector, CA; 1: 3000) timp de 1 oră și spălată în TTBS. Chemiluminiscența a fost detectată prin kitul ECL (Dupont / NEN, SUA). Același protocol a fost utilizat pentru detectarea Bcl-2 (anticorp policlonal anti-iepure anti-Bcl-2 — Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA).

Pentru detectarea caspazelor, proteinele au fost extrase din celule utilizând tampon de liză RIPA (Millipore) și urmând instrucțiunile producătorului. Western blot a fost efectuat cu 20 μg proteină totală (cuantificată folosind testul Bradford, Bio-Rad) pe un gel de poliacrilamidă 10% și tamponat pe membrane PVDF (Millipore, Marlborough, MA). Anticorpii primari împotriva Bax (# 2772), Bcl-2 (# 3498), caspaza-3 (# 9662) și caspaza-7 (# 9492) au fost achiziționați de la Cell Signaling Technology Inc. (Beverly, MA, SUA). Sistemul chemiluminescent (ECL; Amersham Life Science, Buckinghamshire, Marea Britanie) a vizualizat benzile de proteine. Membrana a fost capturată folosind sistemul LI-COR și cuantificată cu software-ul de analiză 1-D Quantity One (Biorad Laboratories). Benzile de proteine ​​au fost normalizate față de nivelul de β-actină (# 4970, Cell signaling Technology).

Declarații de etică

Experimentele au fost efectuate sub aprobare instituțională și s-au depus toate eforturile pentru a evita suferința animalelor.

Leave a Comment

Adresa ta de email nu va fi publicată.